如何合成grna

gDNA如何变成gRNA

另外，与NgAgo结合的gDNA长度为24个碱基，这比与Cas9结合的19个碱基的gRNA要长5个碱基，理论上其精确性要提高1024（4的5次方）倍。

gDNA为双链结构在一定的时期内以gDNA双链中的一条链为信息链（或意义链）在gDNA解旋酶的作用下，gDNA以细胞中游离的脱氧核糖核苷酸为原料，按照碱基互补配对原则采用半保留半复制方式解旋。

为了使cas9编辑真核生物基因组添加了什么

1、cas9基因编辑原理：将CRISPRCas系统嵌入到基因组中，使CRISPR核酸和Cas蛋白能够结合到特定的DNA序列上，从而实现基因编辑的目的。CRISPR-Cas9，一种基因治疗法，这种方法能够通过DNA剪接技术治疗多种疾病。

2、CRISPRCas9是继锌指核酸内切酶（ZFN）”、“类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）”之后出现的第三代“基因组定点编辑技术”。

3、这两种RNA与一种叫做Cas9的蛋白质形成复合物。Cas9是一种核酸酶，可以切割DNA。当能匹配病毒基因的RNA，被称为guide RNA，在病毒基因组中找到它的目标时，Cas9就会切断目标DNA，使病毒失效。

4、CRISPR的效用不仅在于它创造dsb的能力，还在于它依赖细胞自身的机制来修复DNA。 NHEJ和HDR修复途径经常被研究人员用来编辑基因组，方法是敲除基因或敲入感兴趣的序列。

5、因此人们对它进行了改造，将编码Cas9蛋白的序列及其附属元件共同制造成为一个单一的载体。同时为了能够让这些组分进入真核细胞的细胞核，还加入了入核信号元件。

6、正是基于细菌的这种后天免疫防御机制，CRISPRCas9技术应运而生，从而使科学家们利用RNA引导Cas9核酸酶实现对多种细胞基因组的特定位点进行修饰。

CRISPR-Cas9基因编辑2--gRNA设计(下)

粘贴事先准备好的序列--保存Oligo文件 （1）打开一个pSpCas9质粒--actin--restriction cloning--insert fragment （2）在Vector选项卡，选择内切酶为BbsI，在insert部分选择上一步中保存好的oligo，最后点击clone，保存DNA文件。

CRISPRCas9 系统作为细菌和古细菌的获得性免疫系统， 通过 RNA 介导特异性的切割外源遗传物质， 用以对抗入侵的病毒和质粒。利用 Cas9 来摧毁入侵 DNA 的 Type Ⅱ CRISPRCas 系统， 可以在体外进行基因的编辑。

和ZFN，TALEN一样，CRISPR-Cas也是通过激活DSB的模式来达到基因标记的目的。CRISPR RNA （crRNA） array，编码gRNA，再加上tracrRNA，则可达到定位+编辑的功能 gRNA用于引导，tracrRNA用于结合靶点。